he course is aimed at describing structure and function of the chief biological molecules (proteins, carbohydrates, lipids) as well as giving the picture of the complex interaction among metabolic pathways in humans. A section describing the flow of information from DNA to proteins is also included: in this section, the attention will be drawn to the revision of the central dogma of molecular biology. The course will give the essential requirements for the strictly related courses of Applied Biochemistry and Molecular Biology. The course will also offer the background for courses dealing with human diseases and their treatment (Pathology, Pharmaceutical Chemistry and Pharmacology).

STRUTTURA DELLE PROTEINE  

Generalità sul riconoscimento molecolare. Panoramica sulle funzioni delle proteine. Gli amminoacidi delle proteine: proprietà generali, famiglie di amminoacidi. Struttura primaria delle proteine. Il gruppo peptidico: legame peptidico e conformazioni dello scheletro polipeptidico, angoli di torsione φ e ψ. Diagramma di Ramachandran. Strutture secondarie: a elica e foglietto b. Motivi strutturali. Le proteine fibrose. Proteine di membrana e globulari: struttura terziaria. I domini delle proteine globulari. Interazioni stabilizzanti e destabilizzanti nelle proteine. Effetto idrofobico. I ponti disolfuro. Struttura quaternaria. Il folding delle proteine in vitro e in vivo. Chaperon molecolari. Le malattie da misfolding. I prioni. Proteine coniugate e modificazioni post-traduzionali.

LE PROTEINE CHE TRASPORTANO L'OSSIGENO

II gruppo eme. Struttura e funzioni di mioglobina ed emoglobina. Affinità per l'ossigeno e per il CO. Curve di dissociazione dell'ossigeno: confronto tra mioglobina ed emoglobina. Effetto Bohr. Effetto del 2,3-bisfosfoglicerato. Emoglobina fetale. Emoglobina S.  Metaemoglobina. Trasporto della CO₂. Emoglobine patologiche.

GLICIDI

Funzioni dei glicidi. Classificazione. Monosaccaridi:aldosi e chetosi. Amminozuccheri, acido sialico e sialoglicoproteine. Zuccheri riducenti e non riducenti. Il legame glucosidico. Polisaccaridi: cellulosa, chitina, amido, glicogeno. Mucopolisaccaridi e mucopolisaccaridosi, eparina. Glicoproteine. Proteoglicani. Glicolipidi. I carboidrati come marcatori di superficie e recettori di segnali molecolari.

LIPIDI E MEMBRANE BIOLOGICHE

Definizione di "sostanze di natura lipidica". Ruoli biologici dei lipidi. Classificazione dei lipidi. Cere, triacilgliceroli, acidi grassi saturi e insaturi, glicerofosfolipidi, sfingolipidi, steroli e colesterolo, altri composti terpenici (vitamine A, D, E, K, ubichinone, dolicoli). I lipidi come segnali intracellulari (diacilglicerolo e ceramide) ed extracellulari (eicosanoidi). Architettura delle membrane biologiche: il modello a mosaico fluido e…il suo aggiornamento (lipid rafts). Fluidità delle membrane biologiche: effetto dei doppi legami e del colesterolo. Proteine di membrana: integrali, periferiche, monotopiche, GPI-anchored proteins.

ENZIMI - PRINCIPI DI CATALISI

Termodinamica delle reazioni: variazione di energia libera e costante di equilibrio. DG, DG⁰, DG^0I. Velocità di reazione e stato di transizione (equazione di Arrhenius: ΔG di attivazione). Classificazione degli enzimi. Catalisi non covalente e covalente. Teoria dello stato di transizione. Un esempio riepilogativo: le proteasi. Le proteasi a serina: meccanismo di reazione, specificità, attivazione degli zimogeni, esempi. I proteasomi. Le caspasi e l'apoptosi. Proteasi e autofagia. Anticorpi catalitici. Ribozimi.

ENZIMI - CINETICA ENZIMATICA - LE EQUAZIONI FONDAMENTALI

Terminologia: velocità di reazione (v), velocità iniziale (v₀), costanti di velocità (k), costanti di equilibrio (K, di dissociazione e di associazione), dimensioni delle costanti, attività enzimatica e velocità, attività enzimatica specifica. La base sperimentale dell'equazione di Michaelis e Menten. Cinetica di saturazione: equazione e grafico. I modelli interpretativi dell’equazione sperimentale. Significato dei parametri cinetici: K_M, V_max e k_cat, k_cat / K_M; limiti superiori di k_cat / K_M ed enzimi "perfetti". Parametri cinetici degli enzimi regolatori e non regolatori: esempio della glicolisi. Effetto del pH e della temperatura sull'attività enzimatica. Rappresentazione grafica dei dati e determinazione dei parametri cinetici: equazione e grafico di Lineweaver-Burk (limiti e pregi).

ENZIMI - INIBITORI E REGOLAZIONE

Inibitori reversibili e irreversibili. Inibitori reversibili competitivi, acompetitivi, misti e non competitivi. Esempi di inibitori competitivi analoghi di substrato e di stato di transizione. Inibitori irreversibili: inibitori diretti al sito e inibitori suicidi (esempi). Controllo della disponibilità e dell’attività degli enzimi. Tipi di regolazione (esempi). Regolazione allosterica. Cooperatività: modello concertato e modello sequenziale. Attivatori e inibitoli allosterici.

INTRODUZIONE AL METABOLISMO

Generalità sul metabolismo. Processi catabolici, processi biosintetici, processi anfibolici. Termodinamica delle vie metaboliche: ΔG, ΔG°, ΔG°^I. Reazioni esoergoniche, endoergoniche e all’equilibrio. ATP: struttura, proprietà, tipo di reazioni ATP-dipendenti, vie di sintesi dell’ATP. Carica energetica della cellula. Metastabilità dell'ATP.  Composti ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato. Composti ad "alta energia". Coenzimi e vitamine. Coenzima A, reattività dei tioesteri. NADH: reazioni "solite" (deidrogenazioni) e "insolite" (adenilazioni, ADP-ribosilazioni). NADPH: ruolo, distribuzione cellulare, confronto con il NADH. FAD, FMN e flavoproteine. Altri coenzimi derivanti da vitamine: lipoammide, piridossal fosfato, S-adenosil-metionina, tetraidrofolato, biotina, tiamina pirofosfato, coenzima B₁₂, metil-cobalamina. Acido ascorbico. Riepilogo sul controllo (termodinamico e cinetico) del flusso metabolico: tappe di controllo e minimizzazione dei cicli futili..

GLICOLISI

Generalità sul metabolismo dei carboidrati. La “dote” energetica di un metabolita (confronto tra glicidi e lipidi). Ruolo centrale del glucosio-6-fosfato. Reazioni ed enzimi della glicolisi. Meccanismo di reazione della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Termodinamica della glicolisi: DG°^I e DG delle reazioni. Regolazione della glicolisi: enzimi regolatori e loro modulatori. Il fruttoso-2,6-bisfosfato e l'enzima tandem chinasi-fosfatasi. Sintesi del 2,3-bisfosfoglicerato. Destino del piruvato. Fermentazione lattica e alcolica. Collegamento della glicolisi con il metabolismo lipidico.

CICLO DELL'ACIDO CITRICO (CICLO DI KREBS)

II complesso della piruvato deidrogenasi: reazioni, enzimi e coenzimi. Fonti metaboliche di acetil CoA. Reazioni ed enzimi del ciclo. Termodinamica e regolazione (ruolo di ATP e NADH). Ruolo catabolico e biosintetico del ciclo di Krebs. Reazioni anaplerotiche. Collegamento tra il ciclo di Krebs e le altre vie metaboliche. Il ciclo del gliossilato.

TRASPORTO DEGLI ELETTRONI E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

Potenziali redox e termodinamica delle reazioni di ossidoriduzione. I quattro complessi della catena respiratoria e i siti di accoppiamento. Trasportatori fissi e mobili di elettroni: ubichinone, citocromo c e altri citocromi, centri FeS, coenzimi flavinici, centro binuclearFe-Cu. I fornitori di elettroni all'ubichinone. Accoppiamento tra flusso degli elettroni e fosforilazione ossidativa. Sintesi dell'ATP: ipotesi chemiosmotica. Struttura e funzione dell'ATP sintasi. Regolazione. Principali inibitori della fosforilazione ossidativa. Il disaccoppiamento. Sistemi navetta per il trasporto degli elettroni del NADH citosolico. Citocromo c  e apoptosi.

VIA DEI PENTOSO FOSFATI

Generalità, scopi e confronto con la glicolisi. Corredo enzimatico della via dei pentoso fosfati: fase ossidativa e fase non ossidativa. Quattro "scenari metabolici" legati al fabbisogno di NADPH, riboso-5-fosfato e ATP. Fonti di NADPH alternative alla via dei pentosi: enzima malico. NADPH e glutatione reduttasi. Favismo e altre carenze di glucoso-6-fosfato deidrogenasi. Funzioni del NADPH. Reazioni monossigenasiche.

METABOLISMO DEL GLICOGENO

Struttura e funzione del glicogeno. Demolizione del glicogeno: scissione fosforolitica, enzimi deramificanti. Fosfoglucomutasi e destino del glucoso-6-fosfato. Sintesi del glicogeno: ruolo di glicogenina e UDP-glucoso. Enzima ramificante. Costi della sintesi del glicogeno. Regolazione del metabolismo del glicogeno. Il calcio e la calmodulina.

GLUCONEOGENESI

Generalità: il glucosio….ad ogni costo! II glucosio da precursori non glicidici: glicerolo, lattato, alanina-piruvato, amminoacidi (ruolo-cerniera del ciclo di Krebs). Confronto tra glicolisi e gluconeogenesi. La piruvato carbossilasi, un enzima polifunzionale. Gli altri enzimi "peculiari" della gluconeogenesi: PEP-carbossichinasi, fruttoso-l,6-bisfosfatasi e glucoso-6-fosfatasi. Il ciclo di Cori e il ciclo dell’alanina. Regolazione ormonale del metabolismo glicidico: glucagone, adrenalina, cortisolo.

METABOLISMO LIPIDICO - GLI ACIDI GRASSI

Degradazione e sintesi dei triacilgliceroli  nel duodeno, negli adipociti e nel fegato. Destino metabolico di glicerolo e acidi grassi. Degradazione degli acidi grassi. Attivazione degli acidi grassi e trasferimento nella matrice mitocondriale. La b-ossidazione: reazioni, enzimi e coenzimi. Bilancio energetico della b-ossidazione. Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari di atomi di carbonio. La chetogenesi e i corpi chetonici.

Sintesi degli acidi grassi: confronto con la b-ossidazione. Trasporto di equivalenti di acetil-CoA dal mitocondrio al citosol: ruolo del citrato e dell'enzima malico. La acetil-CoA carbossilasi: confronto con altri biotin-enzimi. Organizzazione strutturale della acido grasso sintasi animale. Reazioni della sintesi degli acidi grassi. Costi di trasporto e di produzione. Le prostaglandine. Regolazione del metabolismo degli acidi grassi.

METABOLISMO LIPIDICO - I LIPIDI DI MEMBRANA E IL COLESTEROLO

Il metabolismo dei fosfolipidi (cenni). Il metabolismo degli isoprenoidi in procarioti ed eucarioti: ramificazioni principali. Generalità sulla biosintesi del colesterolo: localizzazione cellulare, diramazioni, fabbisogno di NADPH e ATP (costi di produzione e costi di trasporto). HMG-CoA reduttasi e sintesi del mevalonato, trasformazione del mevalonato nell'unità isoprenica attivata, sintesi dello squalene e sua ossidazione, ciclizzazione dello squalene epossido (esempi di ciclasi animali e vegetali), trasformazione del lanosterolo in colesterolo (patologie associate, ruolo delle monossigenasi). Il carattere aerobico della sintesi del colesterolo. I fattori SREBP e le proteine Hedgehog. Le lipoproteine. Il controllo della biosintesi e del trasporto del colesterolo. L'ipercolesterolemia famigliare. Vecchi e nuovi inibitori della biosintesi del colesterolo. Derivati del colesterolo: ormoni steroidei (glucocorticoidi, mineralcorticoidi, sessuali), steroidi neuroattivi, acidi biliari, vitamina D₃, ossisteroli. Meccanismo d'azione degli ormoni steroidei. Biosintesi degli ormoni steroidei: ruolo delle monoossigenasi. La prenilazione delle proteine: le Ras-farnesil transferasi. Colesterolo (e derivati) e cancro.

METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - CATABOLISMO

II catabolismo delle proteine della dieta e cellulari. Il sistema ubiquitina-proteasoma. Le proteine come riserva “remota” di glucosio. Destino metabolico degli amminoacidi: amminoacidi glucogenici e chetogenici. Deamminazione per transamminazione: meccanismo catalitico. Altre reazioni PLP-dipendenti. Deamminazione ossidativa: la glutamico deidrogenasi. Ruolo catalitico dell'a-chetoglutarato. Eliminazione dell'azoto: organismi ammoniotelici, uricotelici e ureotelici. Sintesi mitocondriale del carbammilfosfato. Ciclo dell'urea: reazioni ed enzimi. Collegameno tra il ciclo dell'urea e il ciclo di Krebs.  Il ruolo centrale del glutammato nel metabolismo azotato. Compartimentazione cellulare e regolazione del ciclo dell’urea. Sintesi di creatina e fosfocreatina.

METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - BIOSINTESI

Biogenesi dell'azoto organico: glutammato deidrogenasi, glutammina sintetasi. Amminoacidi essenziali e non essenziali. Caratteristiche generali della biosintesi degli amminoacidi. Famiglie biosintetiche degli amminoacidi. Sintesi per transamminazione da a-chetoacidi. Interconversione serina-glicina (enzima serina idrossimetil transferasi). Il metabolismo delle unità monocarboniose: i derivati del tetraidrofolato e la S-adenosil metionina. La metilcobalamina. Schema generale del metabolismo delle unità monocarboniose. Biosintesi della tirosina dalla fenilalanina: ruolo della biopterina. Fenilchetonuria e alcaptonuria. Biomolecole da amminoacidi (strutture, funzioni e aspetti biosintetici comuni). Arginina e NO.

METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI

Funzioni dei nucleotidi. Struttura di nucleotidi, nucleosidi, basi puriniche e pirimidiniche. Aspetti generali del metabolismo dei nucleotidi: vie de novo e vie di recupero. Il 5-fosforibosilpirofosfato (PRPP), metabolita chiave delle vie biosintetiche dei nucleotidi. Origine degli atomi degli anelli purinico e pirimidinico e strategie biosintetiche. AMP e GMP da IMP. Formazione dei deossiribonucleotidi: la ribonucleotide reduttasi. Timidilato sintasi: meccanismo di reazione, inibitori, associazione funzionale con la diidrofolato reduttasi. Ipotesi sulla funzione del 5-metile nella timina. Recupero e degradazione dei nucleotidi. Costo della sintesi dei nucleotidi. Riepilogo sull’intreccio metabolico tra amminoacidi e nucleotidi.

CASCATE DI SEGNALAZIONE MOLECOLARE E INTEGRAZIONE DEL METABOLISMO

Segnali molecolari e apparati di interpretazione: generalità, recettori di membrana e recettori nucleari. Proteine G: proprietà generali e classi. Fattori traduzionali (v. anche: sintesi delle proteine - traduzione). Proteine Ras. Proteine G eterotrimeriche:  struttura, classi, ciclo funzionale, cascate inibitorie e stimolatorie dell'AMPc, adenilato ciclasi, fosfodiesterasi (confronto con la cascata del cGMP), proteina chinasi A, tossine. Cascate del PIP₂. Recettori-enzimi. Guanilato ciclasi di membrana e solubile. RTKs (receptors tyrosine kinases). Recettore dell'insulina e simili. Cenno ad altre cascate di segnalazione molecolare. Gli oncogèni e gli oncosoppressori.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Basi puriniche e pirimidiniche di DNA e RNA: forme tautomeriche e loro attitudine alla formazione di legami H. Differenze "chimiche" tra DNA e RNA. Rare Nucleic acid Components (RNC): esempi (basi modificate e altro), metilazioni e protezione da enzimi di restrizione. Struttura di un filamento polinucleotidico. La struttura a doppia elica del DNA. Regola di Chargaff. Appaiamenti standard tra le basi, appaiamenti fra tautomeri rari, impilamento delle basi, solchi maggiore e minore. DNA B, A e Z. Forze che stabilizzano la doppia elica del DNA. Il DNA a tripla elica. Denaturazione del DNA. Temperatura di fusione: dipendenza dalla percentuale di G--C. Topologia del DNA. Il DNA superavvolto e le topoisomerasi. Composizione della cromatina: gli istoni e i nucleosomi. Stabilità evolutiva degli istoni. Acidi ribonucleici: mRNA, tRNA, Rrna, microRNA, RNA virali..

REPLICAZIONE DEL DNA

Caratteristiche generali della replicazione: semiconservatività (esperimento di Meselson e Stahl), bidirezionallità (esperimenti con timidina triziata), unicità di origine nei procarioti (esperimenti con batteri in rapida crescita), semidiscontinuità (esperimenti di Okazaki). Le DNA polimerasi: meccanismo generale di reazione. Apparato di replicazione nei procarioti: elicasi, SSBP, primasi, DNA polimerasi III, DNA polimerasi I, DNA ligasi, topoisomerasi (girasi). La replicazione negli eucarioti. La trascrittasi inversa.

CODICE GENETICO E RNA DI TRASPORTO

Definizione di gene. Definizione e caratteristiche del codice genetico: triplette non sovrapposte, univocità, universalità, ridondanza, ridondanza ordinata. Origine del codice genetico. Decifrazione (esperimenti iniziali). L'RNA transfer: strutture primaria e secondaria, basi modificate, struttura terziaria. Le amminoacil-tRNA sintetasi: attivazione dell'amminoacido e caricamento sul tRNA. Classi I e II di amminoacil-tRNA sintetasi. Fedeltà del processo di caricamento dell'aminoacido sul tRNA. Appaiamento codone-anticodone. Appaiamenti oscillanti (esempio della leucina).

SINTESI E MATURAZIONE DELL'RNA - LA TRASCRIZIONE  E LA SUA REGOLAZIONE

Le RNA polimerasi DNA dipendenti. Struttura dell'RNA polimerasi dei procarioti. Siti promotori in procarioti ed eucarioti, filamenti senso e antisenso. Sintesi dell'RNA su stampo di DNA: inizio, allungamento, terminazione. Le tre RNA polimerasi degli eucarioti. Proprietà catalitiche dell’RNA. Maturazione dei precursore del tRNA e dell’rRNA. Autosplicing e introni di tipo I e II. Maturazione del precursore del mRNA: formazione del cappuccio, metilazioni, poliadenilazione, rimozione degli introni. Discontinuità dei geni degli eucarioti (introni ed esoni): esperimenti di ibridazione DNA-mRNA. Gli spliceosomi e il processo di splicing: meccanismo, accuratezza, confronto con l'autosplicing. Splicing alternativo. Ipotesi sull'origine degli introni. Regolazione dell’espressione genica nei procarioti: operon catabolici (lac-operon) e biosintetici (Trp-operon). Il Lac-operon e il complesso cAMP-CAP. Il Trp-operon e il meccanismo di attenuazione. Cenno alla regolazione dell’espressione genica negli eucarioti: fattori di trascrizione, silenziamento genico, regolazione epigenetica.

 SINTESI DELLE PROTEINE - LA TRADUZIONE

Composizione, struttura e localizzazione cellulare dei ribosomi di eucarioti e procarioti. Ruolo dei fattori GTPasici nella sintesi delle proteine. Sintesi di fMet-tRNA e fase di inizio nei procarioti. Fase di allungamento: ruolo di EF-Tu, EF-Ts, EFG, formazione del legame peptidico, traslocazione. Fase di terminazione. Costo energetico della sintesi delle proteine. Sintesi delle proteine negli eucarioti e sua regolazione (cenni). Inibitori della sintesi delle proteine: antibiotici, tossine.

PROGRAMME

Structure and function of proteins, carbohydrates and lipids

PROTEINS - Structure and properties of aminoacids. Aminoacid families. Peptide bond and secondary structures. Tertiary  and quaternary structure. Folding, unfolding. Chaperones and misfolding diseases. Mioglobin and haemoglobin: the globin fold and heme group. The allosteric behaviour of Hb. Oxygen-haemoglobin dissociation curve. Bohr and 2,3-BPG effects.

CARBOHYDRATES – Classes, functions, structures. Glucose, fructose. Aminosugars and mucopolysaccharides. Mucopolysaccharidoses. LIPIDS- Classes, functions, structures. Saturated and unsaturated fatty acids. Glycerophospho- and sphingolipids. Terpenes and lipophilic vitamins. Cholesterol. Biological membranes.

Enzyme kinetics

An overview on the enzymatic reactions. Transition state theory. Covalent and non covalent catalysis. Proteases: a recapitulating example. Michaelis-Menten kinetics: experimental design and kinetic model. T and pH effect. Kinetic parameters and their measure. Inhibitors: classes and examples. Enzyme regulation. Allosteric enzymes.

Metabolism

INTRODUCTION – Catabolic and biosynthetic processes. Thermodynamics of biochemical reactions. ATP: structure, properties, reactions. Other “high-energy” compounds. Vitamins and coenzymes. METABOLIC PATHWAYS – Glicolysis: functions, reactions, regulation. Lactic fermentation. Pyruvate dehydrogenase complex. Krebs cycle: reactions and multiple connections. Oxidative phosphorylation: function, subcellular localization, respiratory chain complexes. Coenzyme Q, cytochrome c and other electron transporters.  Chemiosmotic theory and F_OF₁ ATP synthase. Penthose phosphate pathway and NADPH requirement. Glycogen metabolism and gluconeogenesis. Fatty acid mobilization and beta-oxidation. Comparison between carbohydrates and lipid degradation. Ketone bodies. Synthesis of fatty acids: transport of acetyl-CoA from mitochondrion, acetyl-CoA activation, fatty acid synthase complex. Regulation of lipid metabolism. Cholesterol biosynthesis and distribution. LDL uptake and hypercholesterolemia. Steroid hormones. Protein prenylation. Protein catabolism. Glucogenic and ketogenic aminoacids. Aminotransferases. Removalofamino acidnitrogen asammonia. Urea cycle. Aminoacid biosynthetic families. Monocarbon unit metabolism, role of tetrahydrofolate and S-adenosyl methionine. Biomolecules from aminoacids. Purines and pyrimidine nucleotide  metabolism: de novo synthesis and rescue. Biosynthetic origin of the atoms inpurineand pyrimidine bases. Synthesis of deoxyribonucleotides and thymine. MOLECULAR SIGNALLING – Membrane and nuclear receptors. cAMP and PIP₂ cascades, G proteins, cGMP, insulin receptor and RTKs.

Molecular biology

STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS –DNA structure: single strand and double helix. Topology of DNA. Chromatin structure and function. RNA types. DNA REPLICATION –DNA replication in prokaryotes: general mechanism, helicases, SSBP, primase, DNA polymerases, ligase, topoisomerases. An outline of  DNA replication in eukaryotes. GENETIC CODE AND tRNA – Genes and genetic code. Decoding the genetic code: initial experiments. tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases. Codon-anticodon pairing and wobbling. PROTEIN SYNTHESIS (TRANSLATION) – Ribosome structure and function. Protein synthesis in prokaryotes: initiating, elongation and termination. RNA SYNTHESIS (TRANSCRIPTION) AND PROCESSING – Differences between eukaryotes and prokaryotes. RNA polymerases and transcription process. Different types of splicing and RNA processing. Introns and exons. REGULATION OF GENE EXPRESSION – Catabolic (Lac-operon) and biosynthetic (Trp-operon) operones in prokaryotes. Regulation in eukaryotes: transcription factors and  chromatin remodelling. RNAi and gene silencing. Epigenetic control and rubbish DNA.

ESSENTIAL REQUIREMENTS

 Good grounding in organic chemistry is essential.