acquisizione delle conoscenze di base circa le metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell’impostazione degli esperimenti e della raccolta dati

Gli studenti dovrebbero acquisire le conoscenze di base delle principali metodiche e strumentazione utilizzate nei laboratori biochimici e di analisi cliniche ed essere in grado di progettare esperimenti e risolvere i problemi pratici relativi all’identificazione, analisi e studio di funzioni delle biomolecole

Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, relazione tra numero di g e rpm, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici in gradiente di sali). 

Colture cellulari. Colture primarie, secondarie, linee. Metodiche colturali.

Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche applicate all’isolamento, alla purificazione e all’analisi di sostanze di interesse biochimico e biochimico-clinico.                            Tecniche elettroforetiche: principi generali: concetto di mobilità elettroforetica e relazione tra mobilità, carica, campo elettrico applicato, dimensioni. Relazione tra punto isoelettrico e mobilità delle proteine. Elettroforesi su strisce di acetato di cellulosa e separazione di siero proteine; elettroforesi su gelo di poliacrilammide ( SDS-PAGE).  Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Elettroforesi di acidi nucleici.      Elettroforesi capillare.                                               Tecniche cromatografiche: Generalità e definizioni.  Caratteristiche ed applicazioni delle cromatografie: di scambio ionico, di esclusione dimensionale (con esempi di determinazione del peso molecolare di proteine), di bioaffinità (con esempi di ligandi e strategie generali per il legame covalente dei ligandi alla fase stazionaria), di interazione idrofobica, di chelazione (IMAC). Esempi di strategie di purificazione di proteine.

 Metodi spettrofotometrici per lo studio delle molecole biologiche ed in enzimologia : generalità e definizioni. Spettri di assorbimento con esempi di spettri di molecole di interesse biochimico: proteine, acidi nucleici, NAD, citocromo c, citocromo P-450. Funzioni e meccanismo catalitico del citocromo P-450. Spettri differenziali, interazioni citocromo-ligandi.  Legge di Lambert-Beer e dosamenti quantitativi. Esempi di dosamenti: dosamento delle proteine e di enzimi: unità di attivita’ enzimatica, attività specifica, fattore di arricchimento durante una purificazione. Saggi enzimatici in cinetica ed a tempo fisso.  Esempi di determinazione di attività enzimatiche    Fluorimetria ed applicazioni in biochimica. Luminometria e sistema luciferina-luciferasi per il dosamento di ATP. Dosamento spettrofotometrico del DNA e studio della temperatura di fusione di un DNA.

Metodiche per lo studio di sequenza e struttura delle proteine.-

Tecniche di biologia molecolare:  Sequenziamento del DNA.   Enzimi di restrizione e mappe di restrizione. Analisi dei polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione, sonde molecolari e diagnostica molecolare. Tecniche di trasferimento di macromolecole dai geli (Southern, Northern, Western Blot) con esempi di applicazioni diagnostiche. PCR e RT PCR quantitativa.

 Saggi immunologici. Nozioni su antigene e anticorpo, anticorpi monoclonali. Sistemi di dosamento immunologico basati sulla marcatura di antigeni od anticorpi con isotopi radioattivi (RIA) e con enzimi (ELISA). Traccianti radioattivi. Nozioni sull’uso dei principali traccianti radioattivi utilizzati nel laboratorio biochimico e biochimico-clinico. Tipi di radiazioni; legge del decadimento radioattivo, tempo di dimezzamento. Unità di misura della radioattività. 

Il corso prevede esercizi dimostrativi e pratici in laboratorio su elettroforesi e cromatografia di proteine, determinazione attività enzimatica e costanti cinetiche.